Pertama, kita akan melihat beberapa jenis bukti {termasuk bukti fisik dan fitur molekuler, informasi geografis, dan fosil) yang memberikan bukti, dan dapat memungkinkan kita untuk merekonstruksi peristiwa-peristiwa makroevolusi.
Fosil
Fosil memberikan bukti kuat bahwa organisme di masa lalu tidak sama dengan yang ditemukan saat ini; fosil menunjukkan perubahan evolusioner bertahap dari waktu ke waktu. Para ilmuwan menentukan umur fosil dan mengkategorikannya di seluruh dunia untuk menentukan kapan organisme tersebut hidup relatif satu sama lain. Catatan fosil yang dihasilkan menceritakan kisah masa lalu, dan menunjukkan evolusi bentuk selama jutaan tahun. Misalnya, catatan fosil yang sangat rinci telah ditemukan untuk urutan spesies dalam evolusi paus dan kuda modern. Catatan fosil kuda di Amerika Utara sangat kaya dan banyak mengandung fosil peralihan: fosil yang menunjukkan anatomi peralihan antara bentuk awal dan akhir. Catatan fosil berasal dari nenek moyang mirip anjing sekitar 55 juta tahun lalu yang memunculkan spesies mirip kuda pertama 55 hingga 42 juta tahun lalu dalam genus Eohippus. Rangkaian fosil tersebut melacak perubahan anatomi akibat tren pengeringan bertahap yang mengubah lanskap dari hutan menjadi padang rumput. Fosil berturut-turut menunjukkan evolusi bentuk gigi serta anatomi kaki dan tungkai menjadi kebiasaan merumput, dengan adaptasi untuk melarikan diri dari predator, misalnya pada spesies Mesohippus yang ditemukan 40 hingga 30 juta tahun lalu. Spesies selanjutnya menunjukkan peningkatan ukuran, seperti spesies Hipparion, yang ada sekitar 23 hingga 2 juta tahun yang lalu. Catatan fosil menunjukkan beberapa radiasi adaptif pada garis keturunan kuda, yang kini menyusut menjadi hanya satu genus, Equus, dengan beberapa spesies.
Meskipun benar adanya kesenjangan dalam catatan fosil, hal ini tidak menjadi bukti yang menentang teori evolusi. Para ilmuwan mengevaluasi hipotesis dan teori dengan mencari tahu apa yang kita harapkan untuk diamati jika suatu gagasan tertentu benar dan kemudian melihat apakah harapan tersebut terbukti. Jika teori evolusi benar, maka kita mengira telah terjadi bentuk peralihan yang menghubungkan spesies purba dengan nenek moyang dan keturunannya. Harapan ini telah terwujud. Ahli paleontologi telah menemukan banyak fosil dengan ciri peralihan, dan fosil baru selalu ditemukan. Namun, jika teori evolusi benar, kita tidak berharap semua bentuk ini terawetkan dalam catatan fosil. Banyak organisme yang tidak memiliki bagian tubuh yang bisa menjadi fosil dengan baik, kondisi lingkungan untuk membentuk fosil yang baik jarang terjadi, dan tentu saja, kita hanya menemukan sebagian kecil dari fosil yang mungkin terawetkan di suatu tempat di Bumi. Jadi para ilmuwan memperkirakan bahwa dalam banyak transisi evolusi, akan terdapat kesenjangan dalam catatan fosil.
Anatomi dan Embriologi
Bukti lain evolusi adalah adanya struktur pada organisme yang memiliki bentuk dasar yang sama. Misalnya, tulang-tulang pelengkap manusia, anjing, burung, dan ikan paus semuanya memiliki konstruksi keseluruhan yang sama. Kesamaan itu dihasilkan dari asal usul mereka dalam nenek moyang yang sama. Seiring berjalannya waktu, evolusi menyebabkan perubahan bentuk dan ukuran tulang-tulang ini pada spesies yang berbeda, namun mereka tetap mempertahankan tata letak keseluruhan yang sama, yang merupakan bukti adanya keturunan dari satu nenek moyang yang sama. Para ilmuwan menyebut bagian-bagian sinonim ini sebagai struktur homolog. Beberapa struktur ada pada organisme yang tidak memiliki fungsi sama sekali, dan tampak seperti bagian sisa dari nenek moyang masa lalu. Misalnya, beberapa ular memiliki tulang panggul meski tidak berkaki karena merupakan keturunan reptil yang memang berkaki. Struktur yang tidak terpakai dan tidak berfungsi ini disebut struktur vestigial. Contoh lain dari struktur peninggalan adalah sayap pada burung yang tidak bisa terbang (yang mungkin memiliki fungsi lain), daun pada beberapa kaktus, jejak tulang panggul pada ikan paus, dan mata hewan gua yang tidak dapat melihat.
Bukti lain evolusi adalah konvergensi bentuk organisme yang berbagi lingkungan serupa. Misalnya, spesies hewan yang tidak berkerabat, seperti rubah kutub dan ptarmigan (seekor burung), yang hidup di kawasan kutub memiliki lapisan putih sementara selama musim dingin agar menyatu dengan salju dan es. Kemiripan tersebut terjadi bukan karena kesamaan nenek moyang, memang yang satu menutupi bulu dan satu lagi bulu, namun karena tekanan seleksi yang serupa—keuntungan karena tidak terlihat oleh predator.
Embriologi, studi tentang perkembangan anatomi suatu organisme hingga bentuk dewasanya juga memberikan bukti keterkaitan antara kelompok organisme yang kini sangat berbeda. Struktur yang tidak ada pada beberapa kelompok sering kali muncul dalam bentuk embrio dan menghilang pada saat mencapai bentuk dewasa atau remaja. Misalnya, semua embrio vertebrata, termasuk manusia, menunjukkan celah insang pada tahap awal perkembangannya. Ini menghilang pada kelompok dewasa terestrial, tetapi dipertahankan dalam kelompok akuatik dewasa seperti ikan dan beberapa amfibi. Embrio kera besar, termasuk manusia, memiliki struktur ekor selama perkembangannya yang hilang saat lahir. Alasan mengapa embrio dari spesies yang tidak berkerabat seringkali serupa adalah karena perubahan mutasi yang mempengaruhi organisme selama perkembangan embrio dapat menyebabkan perbedaan yang lebih besar pada spesies dewasa, meskipun kesamaan embrio tetap dipertahankan.
Biogeografi
Distribusi geografis organisme di planet ini mengikuti pola yang paling baik dijelaskan oleh evolusi bersamaan dengan pergerakan lempeng tektonik sepanjang waktu geologis. Kelompok besar yang berevolusi sebelum pecahnya benua super Pangaea (sekitar 200 juta tahun yang lalu) tersebar di seluruh dunia. Kelompok-kelompok yang berevolusi sejak pecahnya benua tersebut muncul secara unik di wilayah-wilayah di planet ini, misalnya keunikan flora dan fauna di benua utara yang terbentuk dari superkontinen Laurasia dan benua selatan yang terbentuk dari superkontinen Gondwana. Kehadiran Proteaceae di Australia, Afrika bagian selatan, dan Amerika Selatan paling baik dijelaskan oleh kehadiran famili tumbuhan di sana sebelum benua super selatan Gondwana pecah.
Diversifikasi besar hewan berkantung di Australia dan tidak adanya mamalia lain mencerminkan isolasi yang lama di benua kepulauan tersebut. Australia mempunyai banyak sekali spesies endemik—spesies yang tidak ditemukan di tempat lain—yang merupakan ciri khas pulau-pulau yang terisolasi oleh hamparan air sehingga menghambat migrasi spesies ke wilayah lain. Seiring berjalannya waktu, spesies-spesies ini secara evolusioner menyimpang menjadi spesies baru yang terlihat sangat berbeda dari nenek moyang mereka yang mungkin ada di daratan. Hewan berkantung di Australia, burung kutilang di Galápagos, dan banyak spesies di Kepulauan Hawaii semuanya tidak ditemukan di tempat lain selain di pulau mereka, namun menunjukkan hubungan yang jauh dengan spesies nenek moyang di daratan utama.
Biologi Molekuler
Seperti struktur anatomi, struktur molekul kehidupan mencerminkan penurunan dengan modifikasi. Bukti adanya nenek moyang yang sama untuk seluruh kehidupan tercermin dalam universalitas DNA sebagai materi genetik dan hampir universalitas kode genetik serta mekanisme replikasi dan ekspresi DNA. Pembagian mendasar dalam kehidupan antara ketiga domain tersebut tercermin dalam perbedaan struktural utama dalam struktur konservatif seperti komponen ribosom dan struktur membran. Secara umum, keterkaitan kelompok organisme tercermin dalam kesamaan rangkaian DNA mereka—pola persis yang diharapkan dari keturunan dan diversifikasi dari satu nenek moyang yang sama.
Urutan DNA juga menjelaskan beberapa mekanisme evolusi. Misalnya, jelas bahwa evolusi fungsi baru protein biasanya terjadi setelah peristiwa duplikasi gen. Duplikasi ini adalah sejenis mutasi di mana seluruh gen ditambahkan sebagai salinan tambahan (atau banyak salinan) dalam genom. Duplikasi ini memungkinkan modifikasi bebas satu salinan melalui mutasi, seleksi, dan penyimpangan, sedangkan salinan kedua terus menghasilkan protein fungsional. Hal ini memungkinkan fungsi asli protein tetap dipertahankan, sementara kekuatan evolusi mengubah salinannya hingga berfungsi dengan cara baru.